耀世娱乐用户注册中心_一种快速高效获得耐盐碱羊草突变体材料的方法

1.本发明涉及一种利用重离子束辐照和盐碱激发协同诱导技术获得耐盐碱羊草突变体材料的方法。

背景技术：

2.我国盐碱地面积为9.9

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107公顷，占世界盐碱地面积的10％。草地作为我国最大的陆地生态系统受盐碱化影响严重，盐分种类以中性盐nacl的危害最普遍，在东北苏打盐碱地土壤以na2co3或nahco3等碱性盐为主。羊草是我国重要的乡土物种，多年生根茎禾草，粗蛋白含量高，被誉为“禾本科牧草之王”，生态适应性管，具有耐盐碱、耐干旱和耐贫瘠，且粗蛋白含量高，在我国北方草原牧区“三化”草地改良、生态修复及畜牧业发展中发挥着重要作用。然而近年来由于自然和人为因素，90％以上的羊草植被发生了不同程度的退化。随着国家对生态修复和草牧业发展的重视，作为优质牧草羊草引起了广泛的关注，但野生羊草的人工驯化的时间较短，羊草新品种培育研究工作相对缺乏，作为农业芯片的羊草品种数量及种子的产量等都具有严重的制约性，尤其耐盐碱羊草新品种培育成为我国草牧业发展中亟待解决的卡脖子技术难题。

技术实现要素：

3.本发明提供了一种快速高效获得耐盐碱羊草突变体材料的方法。

4.本发明利用快速高效获得耐盐碱羊草突变体材料的方法按照以下步骤进行：

5.一、羊草种子的准备：选取不同羊草种或品系的种子，其中品种或品系数量在5种以上；

6.二、胶带盘的制作：将羊草种子逐个进行排列黏贴透明胶带上，羊草种子胚端向上，凹槽端向下；粘好后再用透明胶带全部盖住，用剪刀剪成内径3.3cm～3.4cm，形成一个封闭的胶带盘；胚端向上的一面朝上，互相不叠加挤压，放入培养皿内，每个培养皿内放置6～10个胶带盘；

7.三、羊草种子重离子束辐照处理：利用离子加速器提供的碳离子束

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对步骤二中的培养皿内的羊草种子进行辐照处理，初始能量为80mev/u，辐照的剂量为40～50gy；

8.四、辐照后的羊草种子盐碱激发处理：步骤三处理的羊草种子置于浓度为100～200mmol/l的nacl或50～100mmol/l的na2co3琼脂培养基中，在培养箱内进行变温萌发培养，其中低温16℃下12小时黑暗培养，高温28℃下12小时光照培养，萌发时间为28～32天；

9.五、羊草突变体的移栽和扩繁：将步骤四中萌发的羊草移栽到盐碱化的土壤中进行扩繁，观察成活情况，即获得了耐盐碱羊草突变体材料。

10.本技术中利用胶带盘来增加处理的羊草种子的数量，从而实现批量获得羊草突变体，然后利用碳离子束

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辐照进行诱变处理，用浓度为100～200mmol/l的nacl或50～100mmol

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的na2co3琼脂培养基中，进行盐碱激发处理，再移栽到盐碱化土壤中进行扩繁，对成活的幼苗进行持续的观察，成功的筛选出具有生产力高、耐盐碱性强的优质突变体

材料。

11.本发明所述的利用重离子束辐照和盐碱激发协同诱变技术快速高效获得耐盐碱羊草突变体材料的方法，将羊草种子进行重离子束辐照诱变处理后，进行高浓度的盐碱激发诱变，从而快速、高效且批量获得耐盐碱羊草突变体材料。本发明属于利用重离子束辐照和盐碱激发协同诱变技术高效获得耐盐碱羊草突变体材料的技术领域，是一种简单高效、易于操作、成本低廉、育种时间短的新方法。

附图说明

12.图1为胶带盘的制作过程；

13.图2是实施例1重离子束辐照和nacl激发协同诱变后得到的耐盐碱突变体；

14.图3实施例1为重离子束辐照和nacl激发协同诱变产生的突变体及致死的幼苗；

15.图4实施例1中获得的耐盐碱突变体进行移栽扩繁。

具体实施方式

16.具体实施方式一：本实施方式利用快速高效获得耐盐碱羊草突变体材料的方法按照以下步骤进行：

17.一、羊草种子的准备：选取不同羊草种或品系的种子，其中品种或品系数量在5种以上；

18.二、胶带盘的制作：将羊草种子逐个进行排列黏贴透明胶带上，羊草种子胚端向上，凹槽端向下；粘好后再用透明胶带全部盖住，用剪刀剪成内径3.3cm～3.4cm，形成一个封闭的胶带盘；胚端向上的一面朝上，互相不叠加挤压，放入培养皿内，每个培养皿内放置6～10个胶带盘；

19.三、羊草种子重离子束辐照处理：利用离子加速器提供的碳离子束

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对步骤二中的培养皿内的羊草种子进行辐照处理，初始能量为80mev/u，辐照的剂量为40～50gy；

20.四、辐照后的羊草种子盐碱激发处理：步骤三处理的羊草种子置于浓度为100～200mmol/l的nacl或50～100mmol/l的na2co3琼脂培养基中，在培养箱内进行变温萌发培养，其中低温16℃下12小时黑暗培养，高温28℃下12小时光照培养，萌发时间为28～32天；

21.五、羊草突变体的移栽和扩繁：将步骤四中萌发的羊草移栽到盐碱化的土壤中进行扩繁，观察成活情况，即获得了耐盐碱羊草突变体材料。

22.本实施方式中步骤二中胶带盘的制作：将宽为5cm的透明胶带的胶面向上绕直径为3.5cm高度为1cm的无盖的培养皿缠绕一圈，固定到桌面，将羊草种子按顺序逐个进行排列黏贴到培养皿盒底的透明胶带上，保证羊草种子胚端向上，凹槽端向下，保证种子之间无重叠挤压，根据种子大小，可以粘贴100～120粒羊草种子，粘好后再用透明胶带全部盖住，用剪刀剪成内径3.3～3.4cm，不破坏种子的任何一部分，形成一个封闭的胶带盘，胚端向上的一面朝上，平放入直径为3.5cm的培养皿内，每个培养皿内放置8个胶带盘，同时在培养皿底端贴上标签，记录种子来源及处理的剂量。其中，胶带盘的制作过程如果图1所示。

23.本实施方式步骤五中将所有萌发的羊草移栽到中盐碱化的土壤中(其中所述的盐碱土中加入适量的蛭石搅拌均匀，土壤与蛭石的比例为1:1，放入直径为15～17cm的塑料双色盆内)，移栽深度为0.3～0.5cm，保持湿润，记录幼苗的成活率。对成活的幼苗进行持续的

观察，筛选出具有生产力高、耐盐碱性强的优质突变体材料。

24.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中所述的nacl培养基中nacl浓度为150mmol/l，na2co3培养基浓度为50mmol/l。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。

25.本实施方式培养基的配置方法：称取7.0g琼脂，溶解到1000ml的蒸馏水中，加入一定的质量的nacl使其浓度为150mmol/l，或者加入一定质量的nahco3使其浓度为100mmol/l，或者加入一定量的na2co3使其浓度为50mmol/l。

26.实施例1利用本发明所述的重离子束辐照和盐碱激发协同诱导技术快速高效获得耐盐碱羊草突变体材料

27.具体如下：2022年4月～6月，研究对象为：以中科1号、中科2号、吉生1号、吉生2号、东北羊草、吉生3号、吉生4号、龙牧3号、农菁11号等9个羊草品种/品系的种子为研究对象。羊草品种/品系的种子为研究对象，利用碳离子束

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辐射诱变，实验按照如下步骤进行：

28.一、羊草种子的准备：选取纯的中科1号等9个品种/品系的羊草种子各1000粒。

29.二、胶带盘的制作：将羊草种子逐个进行排列黏贴透明胶带上，羊草种子胚端向上，凹槽端向下；粘好后再用透明胶带全部盖住，用剪刀剪成内径3.3cm～3.4cm，形成一个封闭的胶带盘；胚端向上的一面朝上，互相不叠加挤压的，放入培养皿内，每个培养皿内放置6～10个胶带盘；；

30.三、羊草种子重离子束辐照处理：利用离子加速器提供的碳离子束

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对步骤二中的培养皿内的羊草种子进行辐照处理，初始能量为80mev/u，辐照的剂量为，剂量分别为0gy、40gy、50gy、80gy和120gy。

31.四、辐照后的羊草种子盐碱激发处理：步骤三处理的羊草种子置于浓度为100～200mmol/lnacl或nahco3或50～100mmol/l的na2co3的琼脂培养基中，在培养箱内进行变温萌发培养，其中低温16℃下12小时黑暗培养，高温28℃下12小时光照培养，萌发时间为28～32天；萌发时间为30天，每天调查羊草种子萌发的个数，实验结束后调查羊草发芽率、半致死率、根苗长、根叶数量等指标。

32.五、羊草突变体的移栽和扩繁：将步骤四中萌发的羊草移栽到盐碱化的土壤中(盐碱化土壤与蛭石的比例为1:1)进行扩繁，观察成活情况，能够正常生长且具有明显的耐盐碱特性的种质资源材料即获得了耐盐碱羊草突变体材料。

33.本实施例中重离子束辐照和盐碱激发协同诱变技术的羊草种子进行盐碱激发驯化产生的突变体及致死的幼苗如图3所示，图3实施例1为50gy重离子束辐照和100mmol

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盐碱激发nacl激发协同诱变产生的突变体及致死的幼苗。本实施例中获得的耐盐碱突变体进行移栽扩繁如图4所示，其中左图是左边黄色架子上的图，刚移栽的情况，苗很弱小，右图是生长了一段时间的情况，苗有了分蘖并能够正常个生长，从图4可以看出重离子束辐照诱变获得耐盐碱羊草突变体材料在中度盐碱地成活并正常生长。

34.具体结果如下：

35.0mmol/l nacl条件下，在0gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率在在33.8～77.5％之间，由低到高分别为33.8％、36.3％、43.8％、46.3％、55.0％、57.5％、58.8％、66.3％、77.5％；移栽后成苗率均为90％以上，几乎所有的幼苗都能够正常萌发和生长，幼苗长势和耐盐碱水平个体之间无显著差异。

36.在100mmol/l nacl胁迫下，在0gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率在在33.8-77.5％之间，由低到高分别为27.5％-80.0％之间，由低到高分别为27.5％、37.5％、43.8％、52.5％、60.0％、60.0％、61.3％、71.3％、80.0％；移栽后成苗率均为90％以上，几乎所有的幼苗都能够正常萌发和生长，幼苗长势和耐盐碱水平个体之间无显著差异。

37.具体结果如下：

38.0mmol/l nacl条件下，在40gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为35.0％、37.5％、32.5％、38.8％、51.3％、53.8％、67.5％、58.8％、73.8％，但幼苗致死率分别为18.3％、27.0％、28.0％、37.0％、37.5％、51.7％、65.1％、70.1％、79.4％，即供试的9个羊草品种/品系中，仅有1个品种(51.7％)的达到半致死率达到理想的诱变效果。

39.100mmol/l nacl条件下，在40gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为15.0％、31.3％、31.3％、31.3％、37.5％、46.3％、57.5％、60.0％、75.0％，但幼苗致死率分别为3.3％、25.0％、36.8％、46.1％、46.7％、48.1％、54.6％、62.1％、75.0％，即供试的9个羊草品种/品系中，有4个品种(46.1％、46.7％、48.1％、54.6％)接近半致死率，达到效果显著高于单独40gy的诱变效果，且移栽到盐碱条件下获得突变体数量多，盐碱条件下生长状况良好，表现出显著的耐盐碱特性。图2是本实施例分别为40gy和50gy重离子束辐照和100mmol

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nacl激发协同诱变后得到的耐盐碱突变体；其中图2中的左图为40gy重离子束辐照诱变在100mmol

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nacl盐碱激发后的羊草耐盐碱突变体。

40.具体试验结果如下：

41.0mmol

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nacl条件下，在50gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为18.8％、32.5％、46.3％、52.5％、57.5％、57.3％、53.8％、67.5％、81.3％，幼苗致死率分别为17.9％、31.5％、46.7％、47.1％、47.3％、47.8％、59.6％、79.5％、100.0％，即供试的9个羊草品种/品系中，有5个品种(46.7％、47.1％、47.3％、47.8％、59.6％)接近半致死率。

42.100mmol/l nacl条件下，在50gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为12.5％、27.5％、30.0％、46.3％、53.8％、60.0％、60.0％、63.8％、67.5％，幼苗致死率分别为21.9％、50.0％、57.0％、57.5％、57.5％、60.3％、61.8％、66.4％、90.8％，即供试的9个羊草品种/品系中，有6个品种(50.0％、57.0％、57.5％、57.5％、60.3％、61.8％)接近半致死率，100mmol/l的nacl达到效果显著高于单独50gy的诱变效果，且移栽到盐碱条件下获得突变体数量多，盐碱条件下生长状况良好，表现出显著的耐盐碱特性。图2是本实施例分别为40gy和50gy重离子束辐照和100mmol

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nacl激发协同诱变后得到的耐盐碱突变体；其中图2中的左图为40gy重离子束辐照和100mmol

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nacl激发协同诱变后得到的耐盐碱突变体；右图为50gy重离子束辐照诱变在100mmol

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nacl盐碱激发后的羊草耐盐碱突变体。

43.具体试验结果如下：

44.0mmol

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nacl条件下，在80gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为2.5％、30.0％、50.0％、51.3％、51.3％、52.5％、70.0％、71.3％、72.5％，幼苗致死率分别为26.0％、31.2％、41.7％、68.5％、74.1％、75.1％、77.7％、86.9％、100.0％，即供试的9个羊草品种/品系中，仅有1个品种(41.7％)接近半致死率，致死率65％以上的品种为6个。

45.100mmol/l nacl条件下，在80gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为10.0％、17.5％、45.0％、47.5％、50.0％、55.0％、61.3％、62.5％、73.8％，幼苗致死率分别为33.1％、60.3％、65.2％、67.3％、72.4％、82.6％、95.5％、100.0％、100.0％，即供试的9

个羊草品种/品系中，有8个品种致死率为60％以上，3个95％以上的致死率，表明80gy的剂量对羊草种子造成了不可逆的损伤。

46.具体试验结果如下：

47.无论在0mmol/l还是100mmol/l nacl条件下，在120gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率与非辐照诱变条件下没有显著差异，甚至发芽率略高于对照处理，但致死率均为100％，所有的种子只有露白现象，幼苗均不能伸长，培养50天左右无任何成苗现象，均死亡。

48.实施例2采用实施实施例1的方法，与实施例不同的是步骤重离子束辐照剂量为50gy，同时步骤四中采用的是含有50mmol/l的na2co3的琼脂培养基，其余与实施例1相同。研究对象为：以中科1号、中科2号、吉生1号、吉生2号、东北羊草、吉生3号、吉生4号、龙牧3号、农菁11号等9个羊草品种/品系的种子为研究对象。

49.具体试验结果如下：

50.50mmol

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na2co3条件下，在50gy辐照诱变下，9个羊草品种/品系的发芽率分别为15.5％、25.0％、32.5％、39.5％、52.5％、60.0％、53.4％、44.8％、68.5％，幼苗致死率分别为25.5％、35.0％、47.5％、49.5％、52.0％、51.0％、43.4％、46.8％、50.5％，即供试的9个羊草品种/品系中，有7个品种(47.5％、49.5％、52.0％、51.0％、43.4％、46.8％、50.5％)接近半致死率，经过在盐碱土中移栽扩繁，9个品种共获得206份耐盐碱羊草突变体。